Nach Angelas Tod (1540) wird bald Kritik an der „ungeschützten“, freien Lebensweise der jungen Frauen laut. Ein eheloses Leben ohne Ordenskleid und Schutz durch Klostermauern war damals schwer vorstellbar, die Leitung der Gemeinschaft durch eine Frau, nach einer Regel, die eine Frau – Angela Merici – verfasst hatte, schien kirchenrechtlich nicht gedeckt.
1563 überträgt eine Priestergemeinschaft zur Glaubensverkündigung in Brescia der Compagnia di Sant` Orsola den Katechismusunterricht für die Mädchen und zugleich den Elementarunterricht in Lesen, Schreiben, Rechnen und Handarbeit. Zugleich übernimmt aber auch der Vorsteher der Priestergemeinschaft einen wesentlichen Teil der Leitung der Ursulinen. In dieser Zeit hat die Gemeinschaft großen Zulauf, ähnliche Gemeinschaften entwickeln sich in ganz Oberitalien.
Mailand ist für die weitere Entwicklung wichtig: dort gründet Erzbischof Karl Borromäus 1566 eine Ursulinengemeinschaft für die Glaubensunterweisung der Mädchen. Er überarbeitet die Regel von Brescia und gibt der Gemeinschaft einen „Padre Generale“. In der Folgezeit entstehen auf sein Anraten hin in vielen Städten Norditaliens Ursulinengemeinschaften, die vielfache Aufgaben in der Unterweisung von Mädchen übernehmen. Die Schwestern leben meist in ihren Familien, es gibt aber schon „Wohngemeinschaften“.
Besondere Bedeutung hat die kirchliche Erneuerungsbewegung nach dem Konzil von Trient aber nicht nur in Oberitalien sondern auch in Frankreich. Besonders in Avignon und benachbarten Städten tun sich Frauen zur religiösen Erneuerung zusammen und es entstehen Ursulinengemeinschaften. In Bordeaux führt schließlich die Kritik an der ungeschützten Lebensweise der Schwestern zur Gründung einer Ursulinengemeinschaft nach der anerkannten Form eines klausurierten (abgegrenzter Wohnbereich der Schwestern) Ordens mit feierlichen Gelübden – allerdings verpflichteten sich die Schwestern durch ein zusätzliches Verspechen zur Erziehungstätigkeit.
Diese monastische Neugründung führt zur europa- und weltweiten Ausbreitung der Ursulinen, sie werden der erste Schulorden für die weibliche Jugend.
Im Jahre 1660 wurden Ursulinen aus Lüttich von Kaiserin Eleonore nach Wien berufen. Von dort aus sind Niederlassungen in Klagenfurt (1670), Linz (1679) und Graz (1686) entstanden.
